Sorgum (Sorghum bicolor L.) merupakan salah satu dari lima komoditas serealia utama dunia dengan daya adaptasi luas pada lahan marginal dan kering. Sorgum hitam, kultivar lokal dengan kandungan antosianin, flavonoid, dan fenolik total tinggi, digunakan sebagai genotipe target penyuntingan gen Non-dormant Axillary Bud 1 (NAB1) berbasis CRISPR/Cas9 melalui Agrobacterium tumefaciens strain EHA105::pRGEB32 yang membawa tiga konstruksi single guide RNA (sgRNA), yaitu sg1.1, sg2.3, dan sg3.1. Penelitian ini bertujuan mengevaluasi pengaruh seleksi Hygromycin bertingkat (10, 15, dan 20 ppm) terhadap daya hidup dan kemampuan regenerasi kalus putatif transforman. Analisis PCR mengonfirmasi keberadaan sisipan sgRNA (±450 bp) pada ketiga konstruksi sebelum transformasi. Penelitian menggunakan rancangan acak lengkap satu faktor (konstruksi sgRNA); data kuantitatif dianalisis dengan ANOVA satu arah dilanjutkan uji Duncan's Multiple Range Test (DMRT) taraf 5%. Viabilitas kalus pada tahap ko-kultivasi tidak berbeda nyata antarkonstruksi (83,5795,00%), begitu pula survival rate, jumlah tunas, dan jumlah daun pada taraf seleksi 10 dan 15 ppm. Namun pada taraf 20 ppm, konstruksi sg1.1 mengalami penurunan tajam survival rate 1 (93,33% menjadi 40,00%) dan jumlah tunas (0,60) yang nyata lebih rendah dibandingkan sg2.3 (2,07) dan sg3.1 (2,00), sejalan dengan rendahnya persentase regenerasi (20,00%) dan efisiensi transformasi putatif (40,00%) pada sg1.1, dibandingkan sg2.3 (86,67%; 93,33%) dan sg3.1 (73,33%; 100,00%). Konsentrasi Hygromycin 20 ppm ditetapkan sebagai taraf seleksi optimum karena mampu menyingkirkan eksplan non-transforman tanpa menghambat kemampuan regenerasi lini yang stabil resisten. Kata kunci: Agrobacterium tumefaciens, CRISPR/Cas9, seleksi Hygromycin, sgRNA, sorgum hitam.